|
一、施工期
本项目施工期涉及改造内容包括:隔断拆改,室内装饰装修,门窗更换,室内给排水系统改造,消防、采暖通风机电气系统改造,增设医疗系统等管线设备,增设多联机空调系统,同步实施建筑周边绿化、室外道路及水电管线等配套工程,加装室外钢楼梯。施工期不涉及土建施工,基本不会产生扬尘,主要影响为施工过程中的设备噪声、施工人员生活污水、固体废物。施工周期较短,产生的影响较小。
一、营运期
本项目营运过程中主要从事各类动物实验,实验内容包括蛋白印迹技术实验、细胞免疫组化实验、免疫荧光实验、肿瘤体外侵袭实验、划痕实验、MTT实验、免疫组化实验、PCR实验、皮下成瘤、不同处理细胞进行小鼠转移实验、小鼠原位模型制备、PDX实验以及大鼠动脉环出芽实验。
1、细胞培养
本项目蛋白印迹技术实验、细胞免疫组化实验、免疫荧光实验、肿瘤体外侵袭实验、划痕实验、MTT实验、免疫组化实验、PCR实验均涉及细胞培养,具体工艺流程及产污节点详见下表。

图2-2 细胞培养工艺流程及产污节点图
注:W1为水浴锅废水、S1为实验废液。
工艺流程简述:
细胞培养在2层细胞间生物安全柜中内进行。
1.1细胞复苏
(1)将细胞从-80℃冰箱或液氮中取出,迅速放入水浴锅中间接加热1min,使其迅速升温至37℃从而液化。
(2)将液化的细胞中加入适量实验前配制好的培养液,转移到15mL离心管内。
(3)使用离心机将离心管以1000rpm转速离心5min。
(4)使用负压吸引器小心弃去并除尽上清液,加入适量配制好的培养液,重悬吹匀后转移到细胞培养瓶中,再放入培养箱内培养。
1.2细胞传代
(1)使用负压吸引器吸掉培养液,以防止培养液对胰酶的终止作用。
(2)加入适量胰酶,并且晃动几下使胰酶在瓶底分布均匀,放入培养箱中。
(3)适当时间后将培养瓶从培养箱取出,显微镜下观察细胞形态变圆、粘附性变弱后加入配制好的培养液终止酶反应。
(4)用配制好的培养液冲洗瓶底,然后吹打细胞悬液使其均匀单个分布。
(5)将悬液1000r离心5min后重悬,安装实际需要将悬液平分到培养瓶内。
1.3细胞冻存
(1)将已经长满的细胞取出,使用负压吸引器吸走培养液后加入适量胰酶,再放入培养箱中孵育适当时间后,观察细胞变化。
(2)再放入配制好的培养液终止反应,用移液器吹打混匀,将悬液转移到15ml离心管内。
(3)使用离心机以1000r的速度离心5min。
(4)使用负压吸引器吸取上清液,加入1-1.5mL细胞冻存液,重悬,加入冻存管内。
(5)将冻存管放入冻存盒内。盖好,放入-80℃的冰箱冻存。
1.4细胞计数
(1)取对数生长期细胞,用适量胰酶消化后,使用离心机离心5min,重悬。
(2)用微量移液器取10μL悬液,沿计数板一侧缓慢加入,确保悬液均匀充满计数池。
(3)在显微镜下计数四角大方格内的细胞数目,求平均值;利用公式计算细胞总数。
实验过程中使用的培养液为1640培养基或DMEM培养基与胎牛血清(FBS)、青链霉素的混合溶液,各种原料均不具备挥发性,不会产生废气。
实验结束后需要对设备、仪器、器具进行清洗,产生的废水进入自建污水处理设施进行处理,经处理后的废水通过管道排放;水浴锅每周换水一次,废水通过污水管道排放;废培养皿、废培养瓶灭菌后与实验废液作为危险废物进行处置。
实验过程中可能产生的含菌气溶胶经生物安全柜净化系统过滤净化后无组织排放。
2、蛋白印迹技术(western blot)实验

图2-3 蛋白印迹技术实验工艺流程及产污节点图
注:G1为β巯基乙醇溶液使用废气,W2为冰浴废水,S1为实验废液、S2为实验器具。
蛋白印迹技术实验在三层实验室内进行。
工艺流程简述:
2.1蛋白提取
(1)参照前文“细胞培养工艺流程”进行细胞培养。
(2)使用配制好的PBS漂洗细胞3次,去除残留培养基。
(3)加入配制好的SDS样品缓冲液,使用细胞刮刀刮落细胞,转移到Ep管。
(4)使用离心机离心15min,取上清。
(5)将Ep管放入95℃的金属浴中加热煮沸5分钟。
2.2蛋白含量测定
使用核酸蛋白微量检测仪测定蛋白含量。
2.3电泳
(1)电泳前准备
使用外购的凝胶板、玻璃板制成有两个孔槽的凝胶凹形样品槽,将配制好的电泳缓冲液(SDS、EDTA、甘氨酸、TRIS、去离子水)倒入凝胶凹形样品槽中再放入电泳仪的电泳槽内。
(2)样品处理
对于蛋白样品直接取相应体积的样品,依次加上适量的配制好的SDS样品缓冲液,混匀。95℃加热(电加热)煮5-10min。
(3)加样
用移液枪取处理过的样品溶液,小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内,将marker加入到其中一个槽内。
(4)电泳
开启电泳仪,待电泳缓冲液中的溴酚蓝标记移动到凝胶底部时,关电源,把电泳缓冲液倒回瓶中。
(5)剥离胶
把电泳槽取出,用刮片把浓缩胶刮掉,取下。留待转膜。
2.4转膜
(1)依据浓缩胶的大小剪取膜和滤纸6片,放入转移缓冲液中平衡10min。
(2)装配转移“三明治”:海绵-3层滤纸-胶-膜-3层滤纸-海绵,每层放好后,赶去夹层中的气泡。
(3)将电泳仪的转移槽置于冰浴中,放入“三明治”,加转移缓冲液,插上250mA电极1h-2h。
(4)转膜结束后,切断电源,镊子取出杂交膜(PVDF膜,后续实验使用)。
2.5封闭
将配制好的5%的脱脂牛奶(脱脂奶粉、TRIS、氯化钠、吐温20配制)在室温环境下,放置在摇床上缓慢匀速摇晃1h。
2.6免疫反应
(1)一抗孵育
配制适宜浓度的一抗(使用一抗、氯化钠、吐温20、Tris混合),依据marker用剪刀将相应的条带剪出,在15mL或50mL离心管中孵育,4℃,过夜。
(2)荧光二抗
配制适宜浓度的二抗(使用二抗、氯化钠、吐温20、Tris混合),室温环境下在摇床上缓慢匀速摇晃1-2h。
2.7化学发光 显影、定影
(1)配制ECL发光液:将ECL发光液A和ECL发光液B按照体积比1:1的比例配制。
(2)将胶片裁剪成需要的大小,放置一旁备用。
(3)将PVDF膜(前文制得的膜)放置于化学发光蛋白印迹成像仪中,在膜上均匀滴加ECL发光液,查看发光的情况。
实验过程中使用的PBS溶液需PBS原料与去离子水进行配制,原料无挥发性,配制过程中无废气产生。SDS电泳缓冲液为十二烷基硫(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)的混合溶液,原料均无挥发性,配制过程中无废气产生。一抗溶液为一抗样本、Tris、氯化钠的混合溶液,二抗溶液为二抗、Tris、氯化钠的混合溶液,原料均无挥发性,配制过程中无废气产生。
实验过程中使用的SDS样品缓冲液为十二烷基硫(SDS)、β巯基乙醇、蛋白酶抑制剂(PMSF)、氟化钠、偏钒酸钠(NaVO3)、溴酚蓝的混合溶液,其中的β巯基乙醇具有挥发性,溶液的配制在通风橱内进行,废气经收集后进入活性炭吸附装置2#进行处理,经处理后通过25m高排气筒P2排放。
实验过程中使用的冰融化后通过管道排放;实验废液、废实验器具作为危险废物进行处置。
实验结束后需要对设备、仪器、器具进行清洗,产生的废水进入自建污水处理设施进行处理,经处理后的废水通过管道排放。
3、细胞免疫组化实验

图2-4 细胞免疫组化实验工艺流程图
注:G2为甲醛溶液使用废气;S1为实验废液;
细胞免疫组化实验在二层细胞间室内进行。
3.1制作细胞爬片
(1)细胞用消化液消化后,用完全培养基重悬细胞,调整细胞浓度为 2~5×105mL;
(2)在无菌培养皿中铺上3块细胞爬片(圆片),圆片间不要重叠;
(3)取细胞悬液分别滴到圆片或载玻片上,注意不要滴到片外,让细胞贴片30min左右;
(4)30min后,在培养皿中补加配制好的培养液,放于培养箱中培养3h左右。
3.2组化前处理
(1)取出培养皿,用PBS 漂洗3次;
(2)使用配制好的4%的甲醛室温下浸泡10~30min;
(3)使用PBS漂洗3 次;
(4)使用Txiton X-100室温下浸泡10-15min;
(5)使用PBS漂洗3次;
(6)使用配制好的3%的过氧化氢处理浸泡10min,以消除过氧化物酶;
(7)使用PBS漂洗3次;
3.3组化(同免疫组化)
贴壁细胞需要做免疫组化时,可以在培养皿里放入盖玻片,让细胞长在上面后,再取出来进行实验。需要注意的是:取出培养好细胞的盖玻片后,PBS洗两次后,室温晾干,泡在配制好的4%的甲醛溶液中固定,10~15min。之后可按“免疫组化实验流程操作”进行后续操作。
实验过程中甲醛的配制在操作台上进行,配制过程中产生的废气经实验室整体排风进入活性炭吸附装置1#进行处理,经处理后通过25m高排气筒P1排放。
实验结束后需要对设备、仪器、器具进行清洗,产生的废水进入自建污水处理设施进行处理,经处理后的废水通过管道排放。实验废液作为危废进行处置。
4、免疫荧光实验

图2-5 免疫荧光实验工艺流程及产污节点图
注:G2为甲醛配制废气、G3为乙醇配制废气;S1为实验废液;
免疫荧光实验在二层细胞间内进行。
4.1免疫荧光所用玻片的处理
(1)玻片的规格:圆形 18mm×18mm可放入12孔盘;
(2)处理方法:
将玻片一片一片的放入75%乙醇中长期保存。
临用时,自然风干,干燥后放入 12孔板。
4.2铺板子
如细胞难以贴壁或需观察细胞骨架的相关指标,需用多聚赖氨酸处理玻片。处理方式为:用滴管吸取1mL多聚赖氨酸滴在盖玻片上,置于培养箱中30-60min,然后用负压吸引器吸干液体,用去离子水冲洗三遍,再用负压吸引器吸干液体,用紫外灯照射(超净台上自带)5-10min,晾干。实验前一天将单细胞悬液铺种在放有玻片的十二孔盘中一个孔中,每个条件做两个复孔,待细胞贴壁12~24h后,进行后续实验分析。
4.3固定
用PBS洗涤细胞3 次,用负压吸引器吸干,将4%的甲醛溶液滴在十二孔盘的每个孔中(1mL/孔),室温环境静置10min ;
4.4防淬灭
吸出甲醛溶液,再用PBS洗3次,加入氯化铵于室温静置10min,用负压吸引器吸出氯化铵,用PBS洗3遍。
4.5通透
加入1mL的0.1%TritonX-100(用PBS缓冲液稀释),静置10min后,用负压吸引器吸出Triton,用PBS洗3次。
4.6封闭
加入1mL配制好的3%的BSA溶液(用PBS缓冲液稀释)室温下静置1h,用负压吸引器吸出BSA 溶液,用PBS 洗3次。
4.7一抗
将外购一抗用上述3%的BSA溶液稀释(稀释比例为1:200-1:500),然后滴到破片上,将玻片从十二孔盘中取出,吸干多余的水分,有细胞的一面接触抗体,室温>1h 或4°C过夜(效果好), 将玻片重新放回到十二孔板中,有细胞的一面朝上,用 PBS洗4次;
4.8二抗
将外购一抗用上述3%的BSA溶液稀释(稀释比例为1:400),操作同一抗,避光室温静置1h,将玻片重新放回到用锡纸包裹的十二孔盘中,有细胞的一面朝上,PBS 洗3次,10min/次;
4.9DAPI染细胞核
将外购的DAPI滴在每个玻片上,避光于室温静置10min,将玻片重新放回到用锡纸包裹的十二孔盘中,有细胞的一面朝上,PBS洗3次;
4.10封片
把封片剂(mowoil)滴在载玻片上,每片 15μL,将有细胞的面朝下。等封片剂干后室温约30min-1h,放在4°C冰箱中避光保存。若需长期保存,则用封口膜封口后放于-20°C冰箱中。
实验过程中乙醇、甲醛的使用及配制均在操作台上进行,配制过程中产生的废气经室内整体排风进入活性炭吸附装置1#进行处理,经处理后通过25m高排气筒P1排放。
实验过程中0.1%Txiton X-100的配制使用配制好的PBS溶液与Txiton X-100进行混合,原料均无挥发性,配制过程中无废气产生。3%BAS溶液的配制使用配制好的PBS溶液与牛血清白蛋白进行混合,原料无挥发性,配制过程中无废气产生。一抗溶液、二抗溶液均为配制好的BAS溶液与外购一抗、二抗的混合,使用原料均无挥发性,配制过程中无废气产生。使用的封片剂主要成分为水、甘油、聚乙烯醇、Tris,均不具备挥发性,因此使用过程中无废气产生。
实验结束后需要对设备、仪器、器具进行清洗,产生的废水进入自建污水处理设施进行处理,经处理后的废水通过管道排放。实验废液作为危废进行处置。
5、Matrigel体外侵袭实验

图2-6 Matrigel体外侵袭实验工艺流程及产污节点图
注:G4为甲醇溶液使用废气,S1为实验废液,
Matrigel体外侵袭实验在三层实验室内进行。
5.1实验前的准备
(1)使用前要将Matrigel提前放入4℃冰箱过夜,溶胶。本项目外购的Matrigel会直接放入4℃冰箱保存。
(2)接触Matrigel的试管、移液吸头等均须4℃预冷。
5.2包被基底膜(冰上进行)
(1)用预冷的移液枪头混匀Matrigel基质成匀浆状。
(2)根据使用需要,用(1640培养基或DMEM培养基)稀释Matrigel。
(3)将稀释的Matrigel胶包被于所需的Transwell小室中,包被量至少覆盖整个生长表面。
(4)培养箱中培养1h。
(5)用无血清培养基轻轻冲洗,以去除未结合的Matrigel。
5.3水化基底膜
用负压吸引器吸出培养板中残余液体,每孔加入50μl含10g/L BSA的无血清培养液,在培养箱中培养30min。
5.4制备细胞悬液
(1)制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12~24h,进一步去除血清的影响。
(2)常规消化细胞,终止消化后离心收集细胞沉淀,PBS洗1~2遍,用含10g/L BSA溶液的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1~10×105个/mL。
5.5接种细胞
(1)取细胞悬液加入transwell小室。
(2)小室加入含趋化因子的培养基,24孔板一般加入500μL,12孔板加入800μL。特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,下层培养液的趋化 作用就减弱甚至消失,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。
5.6培养细胞
室温环境下培养12~48h。
5.7染色和计数
(1)湿润的棉签擦去上室上面的未侵袭细胞。
(2)在甲醇溶液中浸泡10min,再用去离子水洗3次。
(3)移去transwell(镊子拿走),倒置风干。
(4)用0.005%结晶紫染色40min,再用去离子水洗3次。
(5)切膜,用液体石蜡固定,封片,显微镜观察。
实验结束后需要对设备、仪器、器具进行清洗,产生的废水进入自建污水处理设施进行处理,经处理后的废水通过管道排放。废培养皿、废培养瓶灭菌后与实验废液作为危险废物进行处置。
实验操作过程中甲醇使用过程中会有少量废气逸散,经通风橱进入活性炭吸附装置2#中处理,经处理后通过25m高排气筒P2排放。
6、划痕实验

图2-7 划痕实验工艺流程及产污节点图
划痕实验在三层实验室内进行。
6.1标记
在6孔板底面利用直尺用记号笔每隔0.5~1cm均匀的划横线,每孔至少穿过5条线。
6.2加细胞
在6孔板中加入5~8×105个细胞/孔,掌握为过夜能铺满。
6.3划痕
第二天用无菌10μL枪头比着直尺,尽量垂直于背后的横线划痕,枪头要垂直,不能倾斜。
6.4测量记录
分别在孵育0h、4h、8h、12h、24h时光学显微镜下测量伤痕距离并记录,倒置显微镜下采集图像,观察各组细胞迁移情况。
绘制折线图,横坐标为时间,纵坐标为距离。
实验结束后需要对设备、仪器、器具进行清洗,产生的废水进入自建污水处理设施进行处理,经处理后的废水通过管道排放。废孔板灭菌后与实验废液作为危废进行处置。
7、MTT实验

图2-8 MTT实验工艺流程及产污节点图
MTT实验在二层细胞间内进行。
7.1细胞接种
用含10%FBS(用培养基稀释1640/DMEM)的培养液配成细胞悬液,以每孔1000~10000个细胞接种96孔板,每孔体积200μL。
7.2细胞培养
培养箱中培养3~5天。
7.3呈色
培养3~5天后,每孔加MTT溶液(5mg/mL用PBS配)20μL。继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸去孔内培养上清液。每孔加150μL DMSO,室温环境下静置10min,使结晶物充分溶解。
7.4比色
选择572nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
实验结束后需要对设备、仪器、器具进行清洗,产生的废水进入自建污水处理设施进行处理,经处理后的废水通过管道排放。废孔板灭菌后与实验废液作为危废进行处置。
实验操作过程中试剂均无挥发性,因此该实验过程中无废气产生。
8、免疫组化实验

图2-9 免疫组化实验工艺流程及产污节点图
注:G3为乙醇使用废气、G5为二甲苯使用废气,W3为冲洗废水,S1为实验废液
免疫组化实验在三层生化免疫室内进行。
8.1烤片加热
将外购烤片在65℃烤箱中加热1-2h。
8.2脱蜡
从烤箱中拿出切片立即放入二甲苯Ⅰ溶液中静置15min,二甲苯Ⅱ溶液中静置15min,无水乙醇Ⅰ中静置5min,无水乙醇Ⅱ中静置5min,95%乙醇溶液中静置5min,85%乙醇溶液中静置5min,75%乙醇溶液中静置5min。
8.3冲洗
自来水冲洗5min,再用去离子水冲洗3遍。
8.4修复
先将枸橼酸修复液在高压锅中煮沸,然后将含有组织的玻片放入煮沸溶液中,将高压锅盖盖好,当气阀冒气时,开始计时2分40秒,此时将温度调至140℃。计时结束后,关闭电源,用自来水冲洗压力锅锅盖,至气阀自然落下,将锅盖打开,自然降至室温(约40min左右)。
8.5浸泡
用PBS浸泡5min*3次。
8.6封闭
用3%的H2O2浸泡30min。
8.7冲洗
用去离子水冲洗2遍。
8.8 浸泡
用PBS浸泡5min*3次。
8.9Ⅰ抗
加Ⅰ抗(释液+Ⅰ抗的混合溶液,外购稀释液,相关抗体中涵盖),室温放置30min后放入4℃冰箱过夜。
8.10冲洗
第二天拿至室温平衡30min,PBS洗5min*3次。
8.11II抗
加II抗,室温放置1小时。
8.12冲洗
用PBS洗5min*3次
8.13显色
滴加DBA染色液,室温静置2min显色。
8.14冲洗
使用自来水冲洗5min。
8.15复染
滴加苏木素复染,室温静置2min显色。
8.16冲洗<, o:p>
使用自来水冲洗5min。
8.17脱水
依次使用梯度乙醇(75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇)脱水各5min。
8.18浸泡
使用二甲苯浸泡2次,每次15min。
8.19封片
用中性树胶封片。
实验过程中需使用外购的无水乙醇和75%乙醇配制95%乙醇溶液、85%乙醇溶液,配制过程在通风橱内进行,产生的废气经收集进入活性炭吸附装置2#处理,经处理后通过25m高排气筒P2排放。二甲苯的使用在通风橱内进行,产生的废气经收集进入活性炭吸附装置2#处理,经处理后通过25m高排气筒P2排放。
实验结束后需要对设备、仪器、器具进行清洗,产生的废水进入自建污水处理设施进行处理,经处理后的废水通过管道排放。实验废液作为危废进行处置。
9、PCR实验

图2-10 PCR实验工艺流程及产污节点图
PCR实验在二层细胞间内进行。
9.1小鼠DNA提取
从零下20度冰箱取出蛋白酶K,并用其配套的稀释液按1:100稀释,每只小鼠100ul(按只数配取);抓取需进行基因型鉴定小鼠,用剪刀剪取其脚趾或少许尾巴,使用镊子将其放置在1.5ml EP管中,每管使用移液器加入100μL稀释(组织裂解缓冲液,外购)后的蛋白酶K,紧接着13000 rpm离心10 min;然后使用水浴锅56℃水浴8h。水浴后,90℃金属浴1h。
9.2DNA检测
取1μL金属浴后DNA样本,上下游引物各2.5μL,4μL去离子水,以及10μL 2*primer STAR酶(PCR相关酶),于200μLPCR管中混匀;上PCR仪进行实验。
9.3测序
PCR仪器处理后产物,送测序公司外委测序检测。
实验结束后需要对设备、仪器、器具进行清洗,产生的废水进入自建污水处理设施进行处理,经处理后的废水通过管道排放。实验废液、处死的小鼠作为危废进行处置。
10、皮下成瘤实验

图2-11 皮下成瘤实验工艺流程及产污节点图
注:G2为甲醛配制废气;S1为实验废液,S3为废实验器具,S4为大鼠及小鼠尸体。
皮下成瘤实验在三层病理学分析室内进行。
10.1成瘤细胞培养
将培养的需要进行皮下成瘤的细胞培养至密度为80-90%时,用胰酶消化细胞并离心(1000转/min),负压吸引泵吸掉上清液后再用移液器吸取1ml预冷PBS吹打混匀细胞后,再次离心(1000转/min),负压吸引泵吸掉上清液。
10.2细胞沉淀
滴入预冷PBS使细胞沉淀,细胞计数板计数细胞并调整细胞浓度至需要注射的浓度。
10.3小鼠分组
将SPF环境中饲养的小鼠按实验需求随机分组。
10.4麻醉
在注射部位(腹股沟或者背部皮下)用75%乙醇消毒后使用1mL注射器缓慢注射一定体积的细胞悬液至小鼠皮下。
10.5观察记录
注射细胞后每日监测动物状态(包括活动情况、饮食情况等)。
10.6器官称量
待肿瘤开始生长后监测并记录肿瘤生长数据,每2-3天测量一次,绘制生长曲线。待最大肿瘤体积接近1500mm3时终止实验。二氧化碳窒息法安乐死小鼠并剥离肿瘤,电子天平称取小鼠肿瘤质量,拍照记录肿瘤最终的生长状况。
10.7冻存
部分小鼠瘤块放入冻存管后直接进行液氮冰冻用于核酸或蛋白质提取,部分组织用4%甲醛固定后用于后续病理实验等。
甲醛的配制在通风橱内进行,废气经收集后进入活性炭吸附装置2#进行处理,经处理后通过25m高排气筒P2排放。
实验结束后需要对设备、仪器、器具进行清洗,产生的废水进入自建污水处理设施进行处理,经处理后的废水通过管道排放。实验废液、一次性实验器具、处死的小鼠作为危废进行处置。
11、不同处理细胞进行小鼠转移实验

图2-12 不同处理细胞进行小鼠转移实验工艺流程及产污节点图
注:G2为甲醛溶液使用废气;S1为实验废液,S3为废实验器具,S4为小鼠遗体。
不同处理细胞进行小鼠转移实验在三层病理学分析室内进行。
11.1成瘤细胞培养
将培养的需要进行皮下成瘤的细胞培养至密度为80-90%时,用胰酶消化细胞并离心(1000转/min),负压吸引泵吸掉上清后再用移液器吸取1mL预冷PBS吹打混匀细胞后,再次离心(1000转/min),负压吸引泵吸掉上清。
11.2细胞沉淀
用预冷的PBS使细胞沉淀,细胞计数板计数细胞并调整细胞浓度至需要注射的浓度。
11.3小鼠分组
将SPF环境中饲养的小鼠按实验需求随机分组。
11.4麻醉
通过呼吸麻醉机,利用异氟烷完全麻醉小鼠,消毒需要注射的部位,使用1ml注射器(针头为32G)进行细胞悬液注射(肺转移模型行尾静脉注射、全身转移模型在小鼠胸部偏左处刺破胸部皮肤直接进行左心室注射、肝转移模型将麻醉小鼠开腹后探查小鼠肝门静脉并行肝门静脉注射),注射体积为50μL,缓慢推注避免漏液。
11.5观察记录
注射细胞后每日监测动物状态(包括活动情况、饮食情况等)。待细胞注射1-2周后监测并记录肿瘤生长数据。
11.6器官称量
待实验结束,二氧化碳窒息法安乐死小鼠并剥离转移灶生长器官,电子天平称重小鼠器官质量(g),拍照记录转移灶最终的生长状况。
11.7冻存
部分小鼠转移灶放入冻存管后直接进行液氮冰冻用于核酸或蛋白质提取,部分组织器官用4%甲醛固定后用于后续病理实验等。
甲醛的配制在通风橱内进行,废气经收集后进入活性炭吸附装置2#进行处理,经处理后通过25m高排气筒P2排放。
实验结束后需要对设备、仪器、器具进行清洗,产生的废水进入自建污水处理设施进行处理,经处理后的废水通过管道排放。实验废液、一次性实验器具、处死的小鼠作为危废进行处置。
12.小鼠原位模型制备实验

图2-13 小鼠原位模型制备工艺流程及产污节点图
注:G2为甲醛溶液使用废气、G3为乙醇溶液使用废气,S1为实验废液,S3为废实验器具,S4为小鼠遗体。
小鼠麻醉工序在手术室进行,其余工序三层实验室内进行。
12.1成瘤细胞培养
将培养的需要进行皮下成瘤的细胞培养至密度为80-90%时,用胰酶消化细胞并离心(1000转/min),负压吸引泵吸掉上清后再用移液器吸取1ml预冷PBS吹打混匀细胞后,再次离心(1000转/min),负压吸引泵吸掉上清。
12.2细胞沉淀
用预冷PBS重悬细胞沉淀,细胞计数板计数细胞并调整细胞浓度至最终需要注射浓度的2倍浓度。
12.3麻醉
通过呼吸麻醉机,利用异氟烷完全麻醉小鼠,(带被毛小鼠需先剪除手术开口被毛)用75%乙醇对手术暴露处进行消毒,麻醉状态下暴露小鼠器官(如胰腺、肝脏、盲肠、卵巢、肾脏等)。
12.4配制细胞悬液
按体积比为1:1的浓度混匀2倍浓度细胞悬液和基质胶。
12.5细胞悬液注射
使用1ml注射器(针头为32G)将细胞悬液注射到小鼠暴露出来的器官(如胰腺、肝脏,盲肠、卵巢、肾脏等),注射体积为20μL,缓慢推注避免漏液。
12.6观察记录
注射细胞后每日监测动物状态(包括活动情况、饮食情况等)。待细胞注射1-2周后监测并记录肿瘤生长数据。
12.7器官称量
待实验结束,二氧化碳窒息法安乐死小鼠并剥离原位植瘤器官,电子天平称重小鼠相应器官质量,拍照记录转移灶最终的生长状况。
12.9冻存
部分小鼠原发肿瘤组织放入冻存管后直接进行液氮冰冻用于核酸或蛋白质提取,部分组织器官用4%甲醛固定后用于后续病理实验等。
甲醛的使用在通风橱内进行,废气经收集后进入活性炭吸附装置2#进行处理,经处理后通过25m高排气筒P2排放。使用75%乙醇消毒过程中会有少量废气产生,在手术室内无组织排放。
实验结束后需要对设备、仪器、器具进行清洗,产生的废水进入自建污水处理设施进行处理,经处理后的废水通过管道排放。实验废液、一次性实验器具、处死的小鼠作为危废进行处置。
13、PDX实验

图2-14 PDX实验工艺流程及产污节点图
注:G2为甲醛溶液使用废气、G3为乙醇溶液使用废气,S1为实验废液,S3为废实验器具,S4为小鼠遗体。
小鼠肿瘤接种在手术室内进行,小鼠处死在解剖室进行,小鼠观察在动物房内,其余实验操作在三层实验室内进行。
13.1获取离体组织
将离体后的标本(肿瘤组织)迅速置于盛有预冷生理盐水的离心管中。
13.2剪除血管附属物
从盛有预冷生理盐水的离心管中取出标本(肿瘤组织),置于超净台的细胞培养皿中,剪除正常组织及表面的血管附属物。
13.3肿瘤组织处理
迅速将标本转移到一个新的盛有预冷生理盐水的培养皿中,用眼科剪或手术刀将肿瘤组织切成1-2mm3的小块组织(定义为F0代标本),备用。
13.4肿瘤接种
通过呼吸麻醉机,利用异氟烷完全麻醉小鼠,剔除需接种部位周围小鼠毛发,使用75%乙醇消毒接种周围皮肤。剪刀剪开皮肤一个约5mm的小口,并分离皮肤与肌肉组织,用镊子撑开皮肤与肌肉组织后,将肿瘤组织块用镊子送入接种部位,用缝合针线缝合皮肤切口。
13.5观察
接种瘤块后每日监测动物状态(包括活动情况、饮食情况等)。待瘤块接种1-2周后监测并记录肿瘤生长数据。
13.6小鼠处死
待实验结束,二氧化碳窒息法安乐死小鼠并剥离瘤块,拍照记录肿瘤最终的生长状况。
13.7肿瘤细胞剥离及固定
部分肿瘤组织放入冻存管后直接进行液氮冰冻用于核酸或蛋白质提取,部分组织用4%甲醛固定后用于后续病理实验等。
甲醛的配制在通风橱内进行,废气经收集后进入活性炭吸附装置2#进行处理,经处理后通过25m高排气筒P2排放。使用75%乙醇消毒过程中会产生少量废气,在手术室内无组织排放。
实验结束后需要对设备、仪器、器具进行清洗,产生的废水进入自建污水处理设施进行处理,经处理后的废水通过管道排放。实验废液、一次性实验器具、处死的小鼠作为危废进行处置。
14、大鼠动脉环出芽实验

图2-15 大鼠动脉环出芽实验工艺流程及产污节点图
注:G3为乙醇使用废气,S1为实验废液,S3为废实验器具,S4为小鼠遗体。
大鼠动脉环出芽实验在三层实验室内进行。
14.1 实验前准备
(1)使用前要将Matrige提前1天放入4℃冰箱过夜,溶胶。
(2)接触Matrigel的试管、移液吸头、96孔板等均须提前1天放入4℃预冷。
14.2制备动脉环
(1)断颈法处死大鼠,75%的乙醇对大鼠表面进行消毒处理。将消毒后的大鼠腹部朝上固定在解剖板上,并用大头针将腿固定在解剖板上。
(2)用手术刀切开腹部皮肤,解剖剪钝性剥离皮肤。然后用消毒的解剖剪打开胸腔,剪开胸骨和肋骨,移开心脏和肺等组织器官暴露主动脉,可见伴随脊柱被脂肪组织覆盖包裹的主动脉血管。
(3)用钝性止血钳从主动脉靠近主动脉弓的一端开始分离血管,将血管与周围组织剥离,直至腹主动脉到骼动脉的分支处。先从骼动脉分支段剪断主动脉血管,再从主动脉弓段剪断血管,完整的主动脉被分离。
(4)将分离的主动脉转移至无菌的培养皿中,无菌PBS(用真空脉动灭菌器高压除菌)冲洗3-4遍,用无菌注射器向血管内灌注PBS去除血管内血液,小心轻轻剥离血管外层的脂肪组织,用眼科剪将血管分支修剪。
(5)将血管转移到DMEM高糖培养基中,用无菌的眼科剪将主动脉血管剪成大约每段1 mm的血管环,将血管环分散浸泡在DMEM高糖培养基中。
14.3铺动脉环
(1)在96孔细胞培养板每孔中添加 50µl的Matrige,用镊子将血管环转移至基质胶中,保持血管环的管轴与细胞培养板的培养孔底部垂直,并确保每一个血管环都完全浸没到基质胶中。
(2)将组织培养板在室温静置10-15 min后转移至细胞培养箱中37℃孵育一小时。基质胶凝固后,每孔中添加150µl DMEM高糖培养基。
(3)将组织培养板置于细胞培养箱中37℃、5% CO2培养箱中培养,每天观察血管环的情况。待血管环周围出现大量的细胞发散生长样微血管结构时相差显微镜下拍照并计算微血管数量,再进行统计分析。
75%乙醇消毒过程中会有少量废气产生,在解剖室内无组织排放。
实验结束后需要对设备、仪器、器具进行清洗,产生的废水进入自建污水处理设施进行处理,经处理后的废水通过管道排放。实验废液、一次性实验器具、处死的小鼠作为危废进行处置。
15、大鼠、小鼠的处死
15.1断颈处死
此方法只适用于小鼠,也是小鼠痛苦程度最小的处死方法,符合动物福利学。操作简单:一手用抓住小鼠的颈部,一手抓住小鼠尾巴,两手猛的用力牵拉,要求必须能够一次成功,不要让其他小鼠看到同类的处死过程。
15.2腹主动脉放血处死
此方法适用于大鼠,使用之前必须先进行麻醉,后用采血管连接动物腹主动脉进行放血操作。
二、污染物产生及排放情况汇总
表2-10 本项目污染物产生及排放情况一览表
|
污染物种类 |
污染源 |
污染物 |
处理方式 |
排放去向 |
|
废气 |
二层实验废气 |
TRVOC、非甲烷总烃、甲醛、臭气浓度 |
经室内整体排风进入活性炭吸附装置1#中处理 |
25m高排气筒P1 |
|
三层实验废气 |
TRVOC、非甲烷总烃、二甲苯、甲醛、甲醇、臭气浓度 |
经通风橱进入活性炭吸附装置2#中处理 |
25m高排气筒P2 |
|
四层动物房异味 |
臭气浓度 |
整体换风,排风进入一体扰流除臭设备1#处理 |
25m高排气筒P3 |
|
五层动物房异味 |
臭气浓度 |
整体换风,排风进入一体扰流除臭设备1#处理 |
25m高排气筒P4 |
|
六层动物房异味 |
臭气浓度 |
整体换风,排风进入一体扰流除臭设备1#处理 |
25m高排气筒P5 |
|
污水处理站异味 |
硫化氢、氨、臭气浓度 |
添加除臭剂 |
无组织排放 |
|
四层手术间 |
TRVOC、非甲烷总烃、臭气浓度 |
/ |
无组织排放 |
|
废水 |
低浓度实验清洗废水、手术废水 |
pH值、CODcr、SS、BOD5、氨氮、总磷、总氮、粪大肠菌群数 |
经自建污水处理设施处理,采用“调节+接触氧化+沉淀+过滤+消毒”的处理工艺,设计处理规模3m3/d |
通过污水总排口排入市政污水管网,最终进入咸阳路污水处理厂集中处理。 |
|
生活污水 |
pH值、CODcr、SS、BOD5、氨氮、总磷、总氮、动植物油 |
化粪池沉淀 |
|
洗衣废水 |
pH值、CODcr、SS、BOD5、氨氮、总磷、总氮、LAS |
|
纯水制备排浓水、去离子水制备排浓水 |
SS、CODcr |
/ |
|
噪声 |
实验设备、废气处理设备风机、废水处理水泵 |
等效连续A声级 |
选用低噪声设备、厂房隔声、距离衰减 |
/ |
|
固体废物 |
生活垃圾 |
生活垃圾 |
分类收集 |
由城市管理部门负责清运 |
|
一般固体废物 |
废包装物 |
集中收集,暂存于一般固体废物暂存间内 |
外售给物资回收单位 |
|
危险废物 |
实验废液、废实验器具、大鼠及小鼠尸体、废试剂瓶、废垫料、废组织器官、沾染废物、废活性炭、除菌滤网、污水处理站污泥、废灯管、废气处理废水 |
集中收集,暂存于危废暂存间内 |
定期交有资质单位处理处置 |
|